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琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法

 更新时间:2023-02-14 点击量:749

一、实验目的:通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如质粒有3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circμLar DNA,简称 CCCDNA);开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂,(open circμLar DNA, 简称OCDNA);线状质粒DNA ,即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂,(linear DNA,简称L DNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA和开环质粒DNA。
三、主要试剂
琼脂糖、溴酚蓝、TE、TAE、EB、DNA marker.
1. 10 x TAE (10倍体积的TAE储存液)
 配 1000mL 50 ×TAE:Tris 242g,冰乙酸57.1mL,0.5 mol/L EDTA 100 mL pH8.0
    2. 凝胶加样缓冲液(6×):溴酚蓝0.25%,蔗糖40%
    3. 琼脂糖(1%):称1g琼脂糖,放入250 mL三角瓶内,加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液,加热煮沸等其冷至60℃左右,倒入封好的电泳板上。
    4. 溴化乙锭溶液 (EB) 0.5 μg /mL,置棕色瓶避光保存。
四、仪器耗材
电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。
五、实验步骤
1. 制备琼脂糖凝胶:称取0.1g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入10mL 1×TAE缓冲液,至微波炉加热至溶化,取出摇匀,则为1%的琼脂糖凝胶液。
2. 胶板的制备:取有机玻璃内槽,洗净晾干。将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
3. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。待胶凝固后,取出梳子,放在电泳槽内。加入电泳缓冲液至电泳槽中。
4. 加样:将样品5μL与上样缓冲液1μL混合,用移液枪将该混合样品加入样品孔(记录点样顺序及点样量)。同时加入DNA marker作为对照。
5. 电泳:接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5 V/cm。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处,停止电泳。
6. 染色:将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(0.5mg/mL)中,染色10min(戴手套操作)。
7. 观察:在紫外灯下观察凝胶中的条带(戴手套操作),并记录拍照。
8. 有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理,以免污染环境(戴手套操作)。
六、注意事项
1.EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
2.当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡后再观察。
3.电泳时注意导线正负极,防止接反。
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