一、实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circμLar DNA，简称 CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circμLar DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。 三、主要试剂 琼脂糖、溴酚蓝、TE、TAE、EB、DNA marker. 1. 10 x TAE (10倍体积的TAE储存液) 配 1000mL 50 ×TAE：Tris 242g，冰乙酸57.1mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL pH8.0 2. 凝胶加样缓冲液（6×）：溴酚蓝0.25％，蔗糖40％ 3. 琼脂糖（1%）：称1g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。 4. 溴化乙锭溶液 (EB) 0.5 μg /mL，置棕色瓶避光保存。 四、仪器耗材 电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。 五、实验步骤 1. 制备琼脂糖凝胶：称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 1×TAE缓冲液，至微波炉加热至溶化，取出摇匀，则为1％的琼脂糖凝胶液。 2. 胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净晾干。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。加入电泳缓冲液至电泳槽中。 4. 加样：将样品5μL与上样缓冲液1μL混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。同时加入DNA marker作为对照。 5. 电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。 6. 染色：将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（0.5mg/mL）中，染色10min（戴手套操作）。 7. 观察：在紫外灯下观察凝胶中的条带（戴手套操作），并记录拍照。 8. 有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境（戴手套操作）。 六、注意事项 1．EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 2．当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡后再观察。 3．电泳时注意导线正负极，防止接反。 苏州阿尔法生物实验器材有限公司14年专注于凝胶电泳设备，生物实验室仪器设备和生物试剂、PCR耗材、细胞培养耗材供应。 |
