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凝胶电泳的染色方法

 更新时间:2023-03-01 点击量:1351

   凝胶电泳是研究蛋白质性质的一种相对简单、快速和高灵敏度的工具。它是分析化学、生物化学和分子生物学的主要工具。通过电泳分离蛋白质是基于这样一个事实,即带电分子将在施加电场时通过基质迁移。蛋白质电泳分离的基质是聚丙烯酰胺。用于形成聚丙烯酰胺的化学试剂是单体丙烯酰胺和N,N'-双丙烯酰胺(双-丙烯酰胺)。聚合丙烯酰胺和双丙烯酰的方法是使用TEMED(四*基乙二胺)和过硫酸铵。聚丙烯酰胺凝胶内部的聚合形成了一个交联的微孔网络。这种孔隙网络允许小蛋白质分子快速通过,同时减缓较大蛋白质的迁移,这导致蛋白质基于其分子大小实现分离。凝胶电泳是一种检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子量的强有力的生化分析方法。在电泳系统中,蛋白条带染色是一个重要的步骤,因为它直接关系到试验结果能否使用。目前,常用的蛋白质染色方法主要有考马斯亮蓝染色法、银染法、负染法和荧光染色法。
考马斯亮蓝染色法
发展历史:1963 年 Fazekas 等将考马斯亮蓝R-250应用到醋酸纤维素膜上的蛋白质染色。1965年Meyer等人将该方法用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白的染色,其检测灵敏度约为200~500ng。随后考马斯亮蓝染色法逐渐被推广使用,现已成为各实验室
重要的检测方法。染色原理:考马斯亮蓝是二磺酸化的三苯甲烷类染料,在酸性条件下,该染料可通过磺酸基和蛋白质分子上质子化的碱性氨基酸间通过静电相互作用相结合。其次,该染料还可以通过其疏水性基团(苯环)和蛋白质的疏水性区域产生疏水作用力,同时该染料和蛋白还存在氧键和范德华力的作用。
目前广泛用的考马斯亮蓝有G-250和R-250两种,R-250比G-250少2个甲基。游离状态的考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈蓝偏绿色,与蛋白质结合后呈蓝色,考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用于蛋白质含量的测定,也可染胶,但脱色较慢较难。考马斯亮蓝R-250呈蓝色,有轻微红色,与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以常用来对电泳条带染色。
 
考马斯亮蓝染色法的优点:由于考马斯亮蓝具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点,使得该类染料成为常用的蛋白质染色染料。考马斯亮蓝染色法的缺点:染色灵敏度低,约为几十纳克到几微克,对低丰度蛋白质的显色较差;染色时间长,并且凝胶有比较深的背景,需要较长时间的脱色,实验时间较长;由于染色和脱色过程中会使用到甲醇和冰乙酸等有毒或有刺激性气味试剂,对身体健康有害。
银染法
发展历史:1979年,Switzer等发明了更灵敏的银染色方法,该方法比考马斯亮蓝染色灵敏高出2个数量级,它可以检测小至0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。
银染法的原理:在溶液条件下银离子能与蛋白质的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通过静电力相结合,同时银离子还可与组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和赖氨酸上的咪唑、甲硫基、巯基和氨基结合;接着,在碱性条件下,与蛋白质结合的银离子在甲醛等还原剂的还原作用下生成黑褐色的金属银使蛋白质显色。
银染法优点:灵敏度高,可以检测到0.25~1ng的蛋白质,适用于低丰度蛋白质染色。
银染法缺点:甲醛的使用让凝胶中蛋白化学交联,导致质谱不兼容;线性范围窄,不太适合量化;染色步骤复杂,染色过程污染较大,费时费力(需要8~16h);试剂成本较高,需要接触有毒的甲醛;而且,核酸、脂多糖、脂类、醣脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰,导致实验重复率低。
负染法
1987年,LeeC等发明了蛋白质铜负染法,只需五分钟即可SDS-PAGE凝胶上清晰显示6-10ng蛋白质条带。
蛋白质负染法的原理是:将金属离子有选择地沉淀在胶面上,而蛋白质条带不被染色。因此,蛋白质所处区域是透明的,从而达到检测目的。该方法主要包括KCL负染法、氯化铜负染法、氯化锌负染法、氯化镍负染法、醋酸盐负染法和咪唑锌负染法等。
负染法的优点:操作便捷,成本较低。咪唑锌负染灵敏度接近于银染法(1~10ng),蛋白质与锌和咪唑的结合是可以逆转的,洗脱后的蛋白质化学性质没有改变,因而具有良好的质谱兼容性。
负染法的缺点:对比度较差,重现性容易受到多种物理化学因素的影响(例如染色液的pH、温度,胶中阴离子的浓度等),从而限制本方法的广泛使用。
荧光染色法
针对考马斯亮兰染色虽然快速但是灵敏度不够,银染法虽然灵敏度高但是背景较高,结果容易受到核酸,脂类的污染等缺点,人们开始使用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色。
荧光染色法原理是:荧光染料通过静电作用与SDS包裹的质子化蛋白质相结合,搭配荧光扫描仪成像来检测蛋白。
荧光染色法的优点:蛋白质荧光染色法具有线性范围广,灵敏度高(1~100ng/band),质谱兼容性好,适用于高通量蛋白质组学的研究。
荧光染色法的缺点:会用到强烈气味和刺激性的试剂,使用的试剂一般价格比较昂贵;荧光染色一般需要相对较长的处理时间,并且需要配备荧光成像扫描仪之类的特殊设备;荧光染料标记蛋白后会改变其在凝胶中的迁移性质,不同蛋白质样品含有与荧光染料反应的氨基残基不同,导致最终检测到的信号差别比较大;电泳前进行染料标记容易使蛋白质形成发夹结构,造成蛋白质从凝胶向硝酸纤维素滤膜上转移时出现障碍;此外,荧光染料的化学稳定性相对较差、光漂白和光降解现象比较严重。以上因素导致该方法的普及和使用率较低。
 
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