欢迎进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司!
技术文章
首页 > 技术文章 > 重组蛋白表达技术要点

重组蛋白表达技术要点

 更新时间:2023-03-01 点击量:910

大肠杆菌(E.coli)表达重组蛋白的技术经过多年的发展,已经成为一个非常成熟表达系统。为了在大肠杆菌表达体系中获得可溶以高表达产量的蛋白,一个优秀的表达策略是重要的。
为了高效表达有活性蛋白,一般需考虑以下几个因素:
1.宿主体系的选择
细菌、酵母、哺乳动物细胞、丝状真菌和单细胞藻类均可以作为表达宿主,每一种表达宿主都有各自的优缺点。如果需要表达的蛋白具有真核的翻译后修饰(糖基化修饰),那么可以选择酵母、哺乳动物细胞等,而大肠杆菌等原核表达体系则不适用。
大肠杆菌作为表达外源蛋白广泛体系,其优点主要包括:(1)菌体繁殖速度快,20分钟即繁殖一代,如果按照1/100的比例进行接种(MOI),只需要对其培养几个小时即可到达稳定期;(2)容易实现高密度培养,理论培养密度是1×10^13 cells/ml,实际培养过程中如果使用的是LB培养基,在37℃培养密度一般比1×10^10 cells/ml略小。而在低温(<11℃)诱导蛋白表达时,细菌个数几乎不增长。(3)比较容易转染外源DNA,质粒转染效率非常高。
2.质粒的选择
一般来说,重组蛋白表达质粒载体融合了复制子(Replicon)、启动子(promoter)、亲和标签(affinity tags)、筛选标记(selection marker)、多克隆位点(MCS)和融合蛋白去除策略(fusion tag removal strategy),如下图所示:
 
复制子:包含复制起始点及相关顺式作用控制元件(cis-acting control elements)。在选择质粒载体时,质粒拷贝数是一个非常重要参数,应重点考虑。目前可从市场上购买到的载体非常多,如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101等。pET系列载体含有pMB1起始子,在单个菌体中该类质粒的拷贝数通常为15-60;pUC系列含有一个突变的pMB1起始子,在该系列的载体在单个细菌中的拷贝数通常为500–700;pACYC和pBAD系列常被用于双表达体系,如FRET系统,该系列含有p15A起始子,单个细胞中质粒的拷贝数为10-12;pSC101系列载体在单个细胞中的拷贝数较少,通常<5个,此类载体常被用于三种蛋白的共表达。
启动子:在重组蛋白大肠杆菌表达体系中,有多种启动子,入Lac、tac、T7、pL、cspA启动子等。lac启动子是最为常用的启动子之一,当培养基中只有乳糖(lactose)作为碳源时,lac启动子被激活,开始表达重组蛋白。T7启动子作为另外一种经常使用的启动子,当含有T7启动系统的质粒转染进入细菌后,培养至一定浓度后,加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,一种非水解性的乳糖类似物)即可诱导大肠杆菌表达重组蛋白。
抗性筛选标签:质粒载体通常采用的抗性基因包括氨苄青霉素,卡那霉素,氯霉素,庆大霉素和四环素等抗性基因,在重组蛋白表达与纯化过程中,大部分加入的外源抗生素自然降解(如氨苄青霉素37℃条件下半衰期为16小时)或被去除掉,只剩下微量残留(一般<1pg/ml纯化蛋白),我们开发了相应的ELISA试剂盒能够快速检测抗生素残留量(检测灵敏度0.1pg/ml)。
融合标签:为了使蛋白的下游纯化过程更加容易以及促进某些不溶性蛋白可溶表达,通常在表达目标蛋白的N端或C端会加入融合标签。融合标签可分两类:一类是短肽类标签;一类是长肽类标签,主要以融合蛋白(fused partner)形式共表达。短肽标签主要作用是使蛋白下游纯化更加快捷高效,长肽类标签更多的作用是促进蛋白可溶性表达;短肽类标签一般只含几个氨基酸,分子量一般小于2 kDa,对重组蛋白的性质影响较小。亲和标签可以放置在蛋白的C-端或N-端,如需要表达分泌性蛋白,一般放置于C-端,信号肽通常放置于N-端。不同的蛋白标签需要根据具体案例来分析,常用的蛋白标签性质,如下表所示
 
标签去除的酶切位点:对于一般性的生物学研究,蛋白标签可以不用去除,如pull down实验和CO-IP实验,通常需要保留标签(如GST、His标签等)以便将目的蛋白从混合物中直接分离出来。当涉及到蛋白结构研究时,则需要去除目标蛋白的融合标签或融合伴侣。去除蛋白标签的方法可分为两类,一类是酶消化法;一类是化学裂解法。化学裂解法通产被用于融合伴侣蛋白的去除,如CNBr用于裂解与Met氨基酸C-端连接的多肽,该方法优点是价格便宜,缺点是蛋白序列中不能存在其他的Met残基。另一种最为常用的蛋白标签去除方法为酶消化法,如肠激脢(Enterokinase),凝血酶(thrombin),factor Xa和烟草蚀纹病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白标签,使用酶法进行标签的切除通常会残留少数几个氨基酸残基。其中带有His标签的TEV作为一个被广泛用于蛋白标签去除实验的标签,其具有一个非常优秀的特点:在切除标签后,只残留一个Ser或Gly残基或不残留氨基酸残基。
3.蛋白表达宿主的选择
在使用大肠杆菌表达重组蛋白时,常采用BL21(DE3)和K-12衍生菌株作为表达宿主。Studier 于1986年提出BL21菌株,随后不同基因工程修饰菌株相继诞生。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT。Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白,外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基质蛋白。同时BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突变,菌株失去甲基化和降解外源转染质粒的能力,使得质粒能够传代保留至子代细菌中(hsdSB突变基因来源于父辈B834菌株)。另一种时K-12系列菌株,该系列菌株具有两大优点:一个是能够促进胞质中蛋白二硫键的形成(主要原因是trxB(thioredoxin reductase)基因发生突变);另一个是外源质粒能够在宿主菌种中稳定存在(主要原因时recA基因发生了突变)。
常见的重组蛋白表达技术问题汇总
重组蛋白表达永远不是一蹴而就的事情,任何一种方案不会适用于所有案例,蛋白表达可以说是一个不断尝试的过程,下表总结了一些常见的蛋白表达技术问题及其应对策略。
 
更多蛋白组学实验设备、实验室试剂、生物耗材采购等进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司了解。