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CRISPR-Cas9基因编辑实验中的注意事项

 更新时间:2023-03-29 点击量:742

在细胞上做基因研究的一般的过程就是:利用CRISPR-Cas9先做基因除 (Gene Knockout) ,获得基因敲除细胞系纯合细胞:然后分析相关的生物学表型;最后做为对照还需要将原敲除的基因回补会到原细胞系中,做为对照细胞进行实验对比。而利用Cas9进行细胞敲除之后,细胞回补实验室要注意哪些问题? 特别需要考虑的技术原理是那些?如何规划好实验流程,下面我们就一步步的进一下细胞其因敲除和回补实验的效率/价格/周期等。


一、敲除细胞的方式

一般都是纯合基因敲除细胞,当然也可以选择MixClone的方式;纯合基因敲除,基本就是目的基因的所有的拷贝都被敲除,没有任何一个完整的基因拷贝可以起作用;这样的好处就是背景非常干净,做敲除最大的优势也得以体现,缺点就是效率较低,对细胞系要求较高,必须能够形成单克隆MixClone细胞敲除Cell Pool就是成本低,适合大规模筛选,从整体上看生物学表型的影响;缺点就是要看效果,有很多时候效果远不如纯合基因敲除,背景还在。

MixClone™极大地简化了基因编辑流程,周期短至四周,价格只有RNA干扰的一半;技术方法和严格的工艺流程控制,基因编辑效率可以高达80-95%,可直接用于下游基因功能分析。

 

MixClone™的技术流程

二、细胞基因敲除的方法选择

1. 细胞基因敲除策略一-移码敲除:

优点:设计简单,单gRNA就可以发挥作用,成本低;
缺点:鉴定麻烦,需要测序,难以保证一个基因有同样基因型,所以分析麻烦,要保证全都是非3的倍数的移码才能够保证基因敲除,所有很多细胞系是用移码做不到的(基因拷贝数多)。

2. 细胞基因敲除-Cas9X大片段基因敲除:
优点:鉴定简单,可以通过对敲除片段外部设计primer进行目的片段的扩增,同时所有的基拷贝都基本能够导入一致的基因缺失,功能分析简单;

缺点:技术复杂,需要有双gRNA对目的基因片段进行切割,而且要中间片段删除的克隆,成本高、效率较低,其次需要非常多的克隆分析才能有结果,需要更多的筛选克隆工作量。

总结:

移码敲除:是在外显子上切一下,导致非3的碱基缺失或者改变,从而实现整个外显子的蛋白序列的改变(但是对细胞有多染色体,多核现象的细胞,就是多个基因拷贝的细胞,这个基本无法去干净) ; 移码的gRNA作用在外显子上!

大片段敲除:就是在内含子设计一对gRNA,将非3整数的外显子整个片段的删除,或者是整个基因片段的删除; (除了技术复杂,贵点,什么细胞系都能用) ; gRNA一般在内含子上切。

三、基因敲除细胞系的构建策略

1. 通过病毒法稳转Cas9+gRNA获得基因敲除细胞系的流程: 构建载体+包病毒+转染+筛选+克隆+PCR【持续表达,周期长,成本高,效率高】。

2. 通过质粒法瞬转Cas9+gRNA获得基因敲除细胞系的流程: 构建载体+转染+克隆+PCR 【阶段表达,周期短,成本低,效率低】。

3. 通过Cas9X*稳转获得的基因敲除细胞系的流程: 构建载体+转染+筛选+克隆+PCR【持续表达,周期短,成本低,效率高】

4. 通过Cas9蛋白+gRNA获得基因敲除细胞系的流程: 转染+克隆+PCR【阶段作用,周期短,成本高,效率低】

总结可以分为两类:持续的表达Cas9+gRNA与阶段性表达Cas9+gRNA两种。

四、基因回补实验的需要特别注意的问题
1. 一般都是cDNA的回补99%都是用cDNA来做回补,除非有钱的可以使用BAC大片段来做回补的 (可以考虑一下我们的VIRUS-Free技术)。

2. cDNA会不会被gRNA识别切割? 如果是Cas9持续表达的,而且gRNA是作用在外显子的肯定会!所以要特别注意做回补的时候,移码突变的必须要做cDNA突变(就是同义突变,将CRISPR识别的PAM序列去掉才行);要不回补的CDNA也会被切割破坏掉,所以我们不推荐做移码敲除是有原因的,前面省的钱后面再花回去。[注意:之前报道Cas9是可以编辑mRNA的,所以......移码除技术的问题后面比较复杂,很多人做回补实验没有检测到,这个也是其中原因之一]

Cas9X的所有大片段敲除的切割在内含子上,一般没有在cDNA上面有识别切割位点,所以回补实验就简单很多!

除此之外,Cas9X的核心技术还具备“0"偏差的将Cas9模块移除,有需要的科学家可以向我们提出,我们可以将Cas9模块在交付的敲除细胞株里面移除。是不是就更加的放心了?

3. 回补的鉴定问题?

要特别注意移码突变的过程中,有一定概率出现的WB背景杂带的问题比较麻烦? 回补之后的序列可能会干扰到回补片段的表达鉴定。


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