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hTERT-成纤维细胞培养解决方案

 更新时间:2023-03-29 点击量:637


 hTERT成纤维细胞为永生化子宫内膜成纤维细胞 (T HESC) 具有延长的寿命,并且在核型、形态和表型方面与原代亲代细胞相似。在功能上,T HESCs 显示激素治疗后蜕膜化的生化终点。
  THESCs 来源于从患有肌瘤的成年女性身上获得的基质细胞。原代基质子宫内膜细胞通过用来自包装细胞系 pA317-hTERT 的上清液感染而永生化,该细胞系表达 hTERT 和嘌呤霉素抗性基因。

hTERT成纤维细胞培养方案如下:
一、所需材料
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)/F12 (Sigma, D2906)
碳酸氢钠
ITS+ Universal Culture Supplement Premix (BD, 354352)
嘌呤霉素
木炭/葡聚糖处理的胎牛血清(Hyclone,SH30068.03)
胰蛋白酶-EDTA 溶液(HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA)
细胞培养测试的 DMSO 
实验耗材:T75细胞培养瓶、T25细胞培养瓶、nest锥形瓶、移液枪吸头等
实验室仪器:-80冰箱、知楚二氧化碳振荡摇床、恒温水浴锅、瑞宁移液器、液氮罐、倒置显微镜等
二、培养基的制备
这些细胞系的基础培养基是 DMEM/F12,辅以:
1.5 克/升碳酸氢钠
1% ITS+ Universal Culture Supplement Premix
500 纳克/毫升嘌呤霉素
10% 木炭/葡聚糖处理的胎牛血清
三、冷冻细胞的处理程序和培养的启动
为确保高活力,解冻小瓶并在收到后尽快开始培养。如果到达后需要储存冷冻培养物,请将小瓶储存在液氮蒸气中,而不是-70°C。在 -70°C 下储存会导致活性丧失。
有关从每批 ATCC 子宫内膜成纤维细胞中回收的活细胞总数,请参阅产品信息表最后一页上提供的批次特定信息。
准备一个含有推荐的培养基的 25 cm² 或 75 cm² 培养瓶。在添加小瓶内容物之前,应将含有生长培养基的容器置于培养箱中至少 15 分钟,以使培养基达到其正常 pH 值(7.0 至 7.6),并避免在恢复过程中培养基碱度过高的细胞。
在 37°C 水浴中轻轻搅拌解冻小瓶。为减少污染的可能性,请将 O 形圈和盖子远离水。解冻应该很快(大约 2 分钟)。
1.细胞解冻后,请尽快从水浴锅中取出,并使用 70% 乙醇溶液来进行净化。操作过程需要在无菌环境中进行,避免污染。
2.将小瓶内容物转移到含有 6.0 至 8.0 mL 培养基的离心管中,并以大约 125 xg 的速度将细胞悬浮液离心 5 至 7 分钟。
3.丢弃上清液并将细胞重新悬浮在新鲜的生长培养基中(有关推荐的稀释比,请参阅特定于批次的信息)。将此悬浮液添加到准备好的培养容器中。
4.在 37°C、5% CO 2加湿培养箱中孵育培养物。
四、继代培养程序
使用nest的T75锥形瓶进行培养的体积。增加或减少其他尺寸的培养容器所需的解离介质的量。
hTERT成纤维细胞传代培养注意事项
为避免结块,在等待细胞分离时不要敲打或摇动烧瓶。难以分离的细胞可置于 37°C 以促进分散。细胞培养过程中需要每 2 到 3 天更新一次培养基。
1.有关细胞传代培养的浓度,请参阅产品信息表。当确定细胞已准备好进行传代培养时,继续下一步。
2.取出并丢弃介质。
3.向烧瓶中加入 2.0 至 3.0 mL Trypsin-EDTA 溶液,在倒置显微镜下观察细胞,直至细胞层分散(通常在 5 至 15 分钟内)。
4.添加 6.0 至 8.0 mL 的生长培养基,并通过轻轻移液吸出细胞。
5.将细胞悬浮液转移到 15 mL 离心管中,并以大约 125 xg 的速度旋转 5 至 10 分钟。
6.丢弃上清液并在新鲜生长培养基中重悬细胞。将适当的细胞悬浮液等分试样添加到新的细胞摇瓶中。
7.有关推荐的接种浓度,请参阅产品表。
五、细胞冻存
在以下培养基中冷冻细胞:95% 生长培养基,5% DMSO。将小瓶储存在液氮蒸气中。避免将小瓶浸入液氮中。
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