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hTERT 永生化肾上皮细胞培养方法

 更新时间:2023-04-03 点击量:556


    血管平滑肌脂肪瘤是肾脏的良性肿瘤,起源于假定的血管周围上皮样细胞。这些细胞可能会分化成具有黑素细胞、平滑肌或脂肪细胞特征的细胞。然而,血管平滑肌脂肪瘤的研究因缺乏成熟的血管平滑肌脂肪瘤衍生细胞系和良好的动物模型而受到限制。 hTERT 永生化肾上皮细胞来源于血管平滑肌脂肪瘤,因此研究人员现在可以在体外利用这些细胞的原代细胞特性和延长的寿命。
   UMB1949 细胞系  表达 NG2 和 L1,并且在块蛋白 (Tsc2) 的外显子 33 中有一个确定的 5bp 缺失,在块蛋白(和/或错构蛋白)中有突变。因此,该细胞系可用于研究结节性硬化症的信号转导和药物效率。SV7tert PDGFtu1细胞系来源于 SV7tert 植入裸鼠引起的肿瘤。SV7tert 细胞系是一种非致瘤性血管平滑肌脂肪瘤细胞系,通过编码 PDGF-BB 的逆转录病毒进行转导,使 SV40 大 T 抗原和人端粒酶永生化。肿瘤来源的细胞分泌的 PDGF 比植入前细胞多 18 倍,并表现出自分泌转化和表观遗传变化。
细胞培养方案
用单克隆泛细胞角蛋白抗体(绿色)和 Hoechst 染料(蓝色)染色的 CRL-4004。
所需材料
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)
胎牛血清
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水
胰蛋白酶-EDTA 溶液(HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA)
细胞培养测试的 DMSO
培养基
hTERT 永生化肾上皮细胞可以使用加入10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。冷冻细胞的处理程序和培养的启动
为确保高水平的活力,解冻小瓶并在收到后尽快开始培养。如果到达后需要储存冷冻培养物,请将小瓶储存在液氮蒸气中,而不是-70°C。在 -70°C 下储存会导致活性丧失。
有关从每批 ATCC 肾上皮细胞中回收的活细胞总数,请参阅产品信息表最后一页上提供的批次特定信息。
1可以使用配置好的培养基,如需在培养基中添加培养基添加剂需要注意保证培养基的PH保持在7.0-7.6之间。注意培养基的酸碱度变化。
2.在 37°C 水浴中轻轻搅拌解冻小瓶。为减少污染的可能性,请将 O 形圈和盖子远离水。解冻应该很快(大约 2 分钟)。
3.一旦内容物解冻并通过浸入或喷洒 70% 乙醇进行净化,立即将小瓶从水浴中取出。从这一点开始的所有操作都应在严格的无菌条件下进行。
4.将小瓶内容物转移到含有 9.0 mL 培养基的离心管中,并以大约 125 xg 的速度将细胞悬浮液离心 5 至 7 分钟。
5.弃去上清液,将细胞稀释后在在细胞摇瓶中悬浮培养。
6.在 37°C、5% CO 2加湿培养箱中孵育培养物。
细胞的传代和维护
注意:
为避免结块,在等待细胞分离时不要通过敲击或摇动烧瓶来搅动细胞。置于 37°C 以促进分散。
1.通过每 2 到 3 天更新一次培养基来维持培养中的细胞。
2.有关细胞传代培养的浓度,请参阅产品信息表。当确定细胞已准备好进行传代培养时,继续下一步。
3.取出并丢弃介质。
4.用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞以去除血清痕迹。
5.向烧瓶中加入 2.0 至 3.0 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液,在倒置显微镜下观察细胞,直至细胞层分散(通常在 5 至 10 分钟内)。
6.添加 6.0 至 8.0 mL 的生长培养基,并通过轻轻移液吸出细胞。
7.将细胞悬浮液转移到 15 mL 离心管中,并以大约 125 xg 的速度旋转 5 至 10 分钟。
细胞维护
1.丢弃上清液并在新鲜生长培养基中重悬细胞。将适当的细胞悬浮液等分试样添加到新的培养容器中。有关推荐的接种浓度,请参阅产品表。
2.在 37°C、5% CO 2加湿培养箱中孵育培养物。
细胞冻存时的注意事项
可以使用已补发细胞冻存液,也可以使用95% 培养基+5% DMSO进行细胞冻存。避免直接将细胞浸入液氮液相中。

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