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细胞培养干货-干细胞培养基和培养基添加剂

 更新时间:2023-04-04 点击量:781

30 多年来,生物产业一直在为许多细胞类型开发专门的细胞培养基,包括原代细胞和干细胞。细胞培养是生命科学中常见和复杂的技术之一,培养基本身是维持培养中健康、增殖的干细胞的关键因素。所有干细胞培养基的基本成分主要包含:基础培养基、缓冲系统、谷氨酰胺、血清(或血清替代品)、特定生长因子以及其他补充剂等。

一、基础培养基

经典基础培养基(DMEMMEMRPMI 等)是化学成分明确的配方,每种配方都是为支持特定的细胞系或培养条件而开发的。

许多基础培养基起初是使用小鼠成纤维细胞、HeLa 或 CHO 细胞系开发的,并且随着时间的推移进行修改已经建立了适用于多种细胞类型的基础培养基。DMEM/F12 是一种使用较为广泛的干细胞基础培养基,它实质是由(Ham's F12培养基 和DMEM培养基的 1:1 混合物. 

常见的几种基础培养基:

RPMI培养基:由洛斯维·帕克纪念研究所研发

BME培养基 :属于 Eagle 的基础培养基

MEM培养基 :属于改良的 Eagle 培养基

DMEM培养基:Dulbecco 改良型培养基

二、缓冲液

干细胞培养基在满足培养细胞的营养需求之外,还要注意细胞的培养条件。多数哺乳动物细胞生长的PH值为:7.4 左右,所以,维持相对稳定的PH环境也很重要。细胞培养时由于加入了二氧化碳,此时会产生HCO3-从而降低培养基中pH值。

三、碳酸氢钠

为了稳定 CO 2培养箱内 pH 值的变化,碳酸氢钠(NaHCO 3 ) 是一种无毒的天然缓冲液,通常包含在干细胞培养基中。作为一般经验法则,当在 5% CO 2培养箱中培养时,需要1.5 g/L 的 NaHCO 3以将培养基的 pH 值保持在 7.4 

H 2 O + CO 2    ↔ H 2 CO 3      ↔ H + + HCO 3 ¯

NaHCO 3    ↔ Na + + HCO 3 ¯

上面公式所表达的是:细胞培养基中的CO 2产生酸性条件。碳酸氢钠缓冲该反应。

四、肝素

HEPES是一种两性离子有机缓冲液,它的主要作用也是为了维持培养基的 pH 值。如果您所培养的细胞对PH环境较为敏感时,建议添加HEPES这样不仅可以增加缓冲能力还能够将 pH 值稳定在 7.2 至 7.6 范围内。

五、酚红

除了二氧化碳水平以外,细胞的代谢产物、培养基添加剂或其他因素同样会影响到干细胞培养基的 pH 值。所以,在培养基和干细胞培养基中也常常会添加酚红作为视觉 pH 指示剂 pH 值为 7.4 左右时,含有酚红的培养基会呈现红色,并且会随着 pH 值的波动从亮黄色到深紫色不等。如果您的细胞对雌激素比较敏感,请选择不含酚红的培养基,因为这种化合物会模仿某些类固醇激素的作用。

六、酸碱度

PH值

    图为不同PH值下培养基中酚红的视觉展示效果。

 

七、谷氨酰胺

细胞所需要的营养物质还包括:必需氨基酸和维生素。其中L-谷氨酰胺是多数细胞培养基所需要的一种添加剂,它的主要作用是促进氮的储存与向培养细胞的转移。还有谷氨酰胺也常常会添加在干细胞培养基中,主要作用是在高能量需求时作为能量来源使用。所以,一般适用于增殖迅速的细胞类型或在低氧、低代谢条件下培养的细胞。

然而,在培养基介质中时,游离 L-谷氨酰胺比较不稳定。比如:在环境温度大于 4°,细胞培养基中的 L-谷氨酰胺会经过非酶促反应降解为NH3-和焦谷氨酸。所以,一般情况下, L-谷氨酰胺必须在 -20°的低温条件下冷冻保存。

八、 L-丙氨酰/L-谷氨酰胺

L-丙氨酰L-谷氨酰胺也是常添加在干细胞培养基中的物质,起主要作用是:谷氨酰胺的稳定性降低谷氨酰胺的分解速度。例如, L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是一种二肽,即使在 37°下也能在细胞培养基中长期稳定。用 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充干细胞培养基可以延长培养基在 4°下的保质期,并大大减少与谷氨酰胺分解成氨废物相关的问题。

九、生长因子和培养基添加剂

1.生长因子

生长因子、细胞因子和趋化因子是细胞的化学信使。每种干细胞类型都需要补充特定生长因子的培养基,以维持或指导培养物的健康、增殖和分化。例如,在人胚胎干细胞 ES 和诱导多能干细胞 iPS 细胞培养基中通常会添加bFGF生长因子。干细胞培养基中使用的生长因子的质量会对培养产生深远影响。比如:使用高生物活性、高纯度的蛋白质折叠及生长因子可以获得较好的蛋白重组效果。虽然生长因子和细胞因子在处于冻干状态时性能稳定,但当他们添加到培养基中时它的保质期就会变得很短。为避免成分降解,一般会在使用前将它们添加到培养基中。

2.氨基酸

细胞培养基中还经常添加非必需氨基酸 (NEAA)来刺激细胞的增殖并延长细胞的活力。虽然细胞也可以自然合成 NEAA,但在培养基中补充非必需氨基酸可以减少低水平氨基酸水平所带来的的副作用。

3.抗生素

实验室经常使用补充抗生素来控制在营养丰富的细胞培养环境中可能出现的细菌污染物的生长。除了原代细胞分离以外,不建议在干细胞培养中使用抗生素,因为常规的抗生素虽然可以防止污染发生,但是容易导致耐药菌株的出现,甚至会干扰到细胞的正常代谢。

十、血清以及血清替代品

1.血清

多数哺乳动物细胞培养需要在培养基中添加血清。用于细胞培养的血清包含蛋白质、肽、生长因子、氨基酸、脂质、碳水化合物、激素、维生素等多种细胞所需的营养成分。干细胞培养基的胎牛血清 (FBS)添加含量通常含在 10% 至 20% 之间。

2.无血清培养基

无血清 (SF) 培养基允许研究人员在无血清的情况下培养干细胞。无血清干细胞培养基的主要优点是从更纯的培养基配方中获得一致且可重复的实验结果。一般来说,无血清培养基被认为是成分确定的培养基,含有白蛋白、胰岛素、硒和转铁蛋白来代替 FBS。然而,成分确定的无血清培养基可包括血清来源的蛋白质,例如人血清白蛋白 (HSA)

重要的是要知道,干细胞在无血清环境中培养时会更加敏感。这在形态学、细胞密度、增殖率以及对机械和化学应力(包括解离酶和抗生素)的敏感性方面尤其明显。例如,如果在无血清培养基中使用抗生素,通常最好使用终浓度为通常用于含血清培养基的1/5至 1/10 

对于实验要求不高的用户或者想节约成本可以使用干粉培养基自行配制,但多数情况下都会选择配置好的培养基或干细胞培养基,这样开瓶后就能直接使用了。不仅可以节约时间,还省去了配制时的繁琐环节。

 苏州阿尔法生物实验器材有限公司 除了供应MEM培养基、DMEMF12培养基、RPMI培养基等基础培养基外,还提供细胞专用培养基、无血清培养基、低血清培养基、 干细胞培养基 、胎牛血清、鸡血清等细胞培养试剂以及实验耗材和实验室仪器。