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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤

 更新时间:2023-06-13 点击量:913

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠), SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用试剂及设备

试剂:蛋白值样品,SDS-PAGE loading buffer,PBS,Tris-Hcl (PH 8.8), Tris-Hcl (PH 6.8) ,30%丙烯酰胺,10%SDS,10%过硫酸,5×SDS-PAGE电泳缓冲液,考马斯亮蓝R-250染色液,脱色液、天能预制胶。

仪器耗材:垂直电泳槽,电泳仪,电泳仪电源,移液枪,移液枪tip吸头,离心管、试剂瓶。


实验步骤

一、凝胶配置

1.分离胶的配制



电泳槽


(1)找出配套的胶板,用擦镜纸擦干净,并固定在配胶器上。随后用去离子水试漏;

(2)若胶板不漏水,就进行分离胶的配制。依次将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl(PH 8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中,混匀(1mm的胶板,一般配一块胶用5ml。所配的胶浓度一般为12%,但浓度也要视情况而定。蛋白越小,胶的浓度越大);

(3)将胶板中的水倒掉,并用滤纸吸干水分(不要将滤纸塞到胶板底部);

(4)小烧杯中再加入TEMED,混匀。(TEMED可使胶凝固,所以最后加);

(5)灌胶:混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下,防止产生气泡;

(6)用水将分离胶压平(用水灌满,同时加水时要缓慢加入,防止把胶吹起)。

也可以直接使用预制胶,预制胶直接拆开即用,不用配制。

2.浓缩胶的配制



SDS-PAGE



(1)待分离胶与水中间形成明显的横线,即分离胶凝固。随后进行浓缩胶的配制,依次将水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl(PH 6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中;

(2)将分离胶上层的水倒掉,并用滤纸吸干水分(尽量不要把滤纸插入);

(3)小烧杯中再加入TEMED,混匀;

(4)灌胶。然后插入梳子;

(5)把制胶器倒过来,胶仍然不会往外流,或可以明显看出梳子中两个齿之间的胶面明显凹下去,说明浓缩胶凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内,并在电泳槽内加入SDS-PAGE电泳缓冲液,把胶浸泡一段时间,时间越长越好(防止梳子与胶相连,或胶因湿度不够而缩减);

(6)点样时,再把梳子拔出来,拔时动作要轻,防止胶齿被拔断。

二、SDS-PAGE电泳步骤


1、调胶:拔掉SDS胶上的梳子,并用小针调整齿的位置(使它们都平行)。

2、点样:用20µL的小枪头,吸煮过的样品10µL,对准胶孔点样,注意不要把样品点在外面。使用适当的分子量蛋白marker。

3、电泳:电泳仪正负极接好,打开电源。浓缩胶:电压 low 100V,分离胶:电压 high 150V。

4、卸胶:等胶内的所有的蓝色都跑出去,电泳停止,一般时间为1-2小时左右。把胶板从电泳仪上卸下,用刀片把胶板撬开,胶的浓缩胶部分割除;

5、染色:放入考马斯亮蓝R-250染色液中进行常温过夜染色;

5、脱色:将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色,直到背景发白。

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