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蛋⽩质三维结构预测方法

 更新时间:2023-08-09 点击量:408

对于SBDD来说,蛋⽩质三维结构在原⼦⽔平上的精度对预测相互作⽤是⾄关重要的。解析蛋⽩质结构时,X-射线衍射(XRD),冷冻电⼦显微镜(Cryo-EM)和核磁共振(NMR)是三种常⽤的实验技术,在蛋⽩质结构解析领域应⽤、发展了这三种技术的⼏位科学家都因此获得过诺⻉尔奖。这三种技术各⾃具有不同的特点和适⽤范围,选择合适的技术取决于研究对象的性质、分辨率要求以及实验条件等因素。

X-射线衍射法

X-射线衍射技术是鉴定蛋⽩质结构的⾦标准。XRD可以实现较⾼的分辨率,通常可以达到1到2埃。因此,它可以提供⾮常详细的原⼦级别的结构信息。然⽽蛋⽩质晶体的⽣⻓对XRD来说是⼀个很⼤的挑战,因为不是所有蛋⽩质都能够形成⾼质量的结晶。对于难以结晶的蛋⽩质,获得合适的晶体可能需要花费⼤量时间和努⼒。这也就是为什么当科学家解析出⼀个新的蛋⽩质结构通常都可以发CNS的原因。

蛋⽩质三维结构的精度通常⽤“分辨率"来表示,单位为埃(Å),分辨率衡量了衍射图像以及计算电⼦密度图时看到的细节⽔平。如果晶体中的所有蛋⽩质都以相同的⽅式排列,形成⼀个晶体,那么其中所有的蛋⽩质分⼦都会以相同的⽅式散射X-射线,使衍射图能够显示出晶体的精细细节。 另⼀⽅⾯,如果晶体中的蛋⽩质都略有不同,例如由于局部柔性或运动等产⽣了结构差异,衍射图案就不会包含那么多的精细的信息。分辨率值为1 Å左右的结构属于⾼分辨率结构,其晶体是⾼度有序的,因此很容易在电⼦密度图中看到每个原⼦。⽽分辨率⼤于3 Å的结构仅显示蛋⽩质链的基本轮廓,原⼦的位置只能通过推测得知。不过,⼤多数由XRD解析的蛋⽩质结构都介于这两之间。

蛋白三维结构.jpg


上图为不同分辨率下的myoglobin蛋⽩的电⼦云密度图,1.0 Å分辨率下的原⼦位置清晰可辨; 2.0 Å分辨率下虽然每个原⼦的位置已经⽆法清晰辨认,但氨基酸残基整体的形状仍然清晰, 可以⽐较准确地确定原⼦位置;当分辨率来到2.7 Å,氨基酸残基的形状已经变得模糊,准确 推断原⼦位置具有较⼤困难;对于3.0 Å分辨率的结构,⼏乎⽆法从电⼦云密度图辨认出残基 的形状,仅能看到此处有⼀个残基存在。读者可点击此处的链接⾃⾏观察不同分辨率下的电⼦ 云形状:1A6M(1.0 Å)、106M(2.0 Å)、108M(2.7 Å)、1S0H(3.0 Å)。

核磁共振技术

核磁共振技术通过分析蛋⽩质样品中的信号来解析蛋⽩质的结构。需要利⽤特定的同位素标记 ⽅法(如15N或13C标记)将⽬标蛋⽩质中的⼀部分原⼦标记上,再通过2D相关实验(如1H[1]15N HSQC或1H-1H COSY)确定原⼦间的连接关系及三维空间排布。基于实验测得的NMR数 据,使⽤计算⽅法和算法对蛋⽩质的结构进⾏计算和模拟,如分⼦动⼒学模拟、模拟退⽕等得 到蛋⽩质的三维结构模型。

NMR的分辨率通常较低,且⼀般只能⽤来分析较⼩的蛋⽩质⽚段的结构,通过多次采样来得 到溶液中蛋⽩质的平均位置。然⽽,NMR对样品的要求较为灵活,可以提供有关蛋⽩质动态 ⾏为、柔性区域和构象变化的重要信息。

冷冻电⼦显微镜技术

冷冻电⼦显微镜是近年来⾼速发展的技术,通过观察蛋⽩质的冷冻样品中的电⼦显微图像来解析蛋⽩质的结构。Cryo-EM技术不需要蛋⽩质结晶。相反,它使⽤冷冻技术来固定溶液中的蛋⽩质构象,从⽽可以研究⾮晶态或⽆规则结构的蛋⽩质。在过去,Cryo-EM的分辨率不怎么⾼,通常只能达到⼏⼗埃,仅能分辨出蛋⽩质颗粒的⼤致轮廓。2017年的诺⻉尔化学奖授予了Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家,他们三者的⼯作极⼤地提⾼了Cryo-EM技术获得的蛋⽩质图像分辨率。⽬前,Cryo-EM技术获得的蛋⽩结构可达到数埃的分辨率,能够⼤致看出分⼦的轮廓与肽链⾛向。PDB数据库中使⽤Cryo-EM⽅法解析出的分辨率最⾼的蛋⽩质已经具有原⼦级的精度,分辨率达到了1.15 Å(PDBID:7A6A),不过,这些⾼精度的结构仅占极⼩的⽐例,⼤部分结构的精度还处于3-5 Å的中等分辨率下。

由于⽆需结晶,也不⽤解析复杂的核磁共振信号,Cryo-EM在⼤分⼦和超⼤分⼦的结构解析上⾮常有优势,如⼤蛋⽩质复合物、膜蛋⽩和病毒等。此外,Cryo-EM还能够提供动态过程的信息,如蛋⽩质的构象变化。

微晶子.png


微晶电⼦衍射技术

除了以上提到的三种技术外,近年来⼀种新的结构解析⽅法——微晶电⼦衍射(Micro-ED)——正⾼速发展起来。该技术可以快速、⾼分辨率的测定⼩分⼦化合物和⽣物⼤分⼦的3D结构。其使⽤电⼦作为⼊射光束,在冷冻透射电镜(cryo-TEM)上获得电⼦衍射数据。由于Micro-ED采⽤电⼦⽽⾮光⼦作为射线,电⼦相⽐光⼦拥有更短的德布罗意波⻓,因此其与物质作⽤的强度更强,能够分析很⼩的晶体并达到很⾼的分辨率。通常Micro-ED只需使⽤约100纳⽶的⼩晶体,在⼏分钟内就能完成数据采集。并且数据采集过程可以直接得到电⼦的相位信息,⽽⽆需进⾏相位重建。数据处理⽅⾯,采⽤常规的XRD解析⼯具就能解析Micro-ED数据,这更近⼀步降低了其应⽤⻔槛。

    不过,Micro-ED并不太适合⼤尺⼨蛋⽩的结构解析,其更适⽤于解析短肽以及⼩分⼦化合物。例如天然产物的结构解析或药品⽣产中对API的分析等。⾃2013年应⽤以来,已经有数百篇Micro-ED相关的论⽂发表。

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