X-射线衍射法
X-射线衍射技术是鉴定蛋⽩质结构的⾦标准。XRD可以实现较⾼的分辨率，通常可以达到1到2埃。因此，它可以提供⾮常详细的原⼦级别的结构信息。然⽽蛋⽩质晶体的⽣⻓对XRD来说是⼀个很⼤的挑战，因为不是所有蛋⽩质都能够形成⾼质量的结晶。对于难以结晶的蛋⽩质，获得合适的晶体可能需要花费⼤量时间和努⼒。这也就是为什么当科学家解析出⼀个新的蛋⽩质结构通常都可以发CNS的原因。
蛋⽩质三维结构的精度通常⽤“分辨率"来表示，单位为埃（Å），分辨率衡量了衍射图像以及计算电⼦密度图时看到的细节⽔平。如果晶体中的所有蛋⽩质都以相同的⽅式排列，形成⼀个晶体，那么其中所有的蛋⽩质分⼦都会以相同的⽅式散射X-射线，使衍射图能够显示出晶体的精细细节。 另⼀⽅⾯，如果晶体中的蛋⽩质都略有不同，例如由于局部柔性或运动等产⽣了结构差异，衍射图案就不会包含那么多的精细的信息。分辨率值为1 Å左右的结构属于⾼分辨率结构，其晶体是⾼度有序的，因此很容易在电⼦密度图中看到每个原⼦。⽽分辨率⼤于3 Å的结构仅显示蛋⽩质链的基本轮廓，原⼦的位置只能通过推测得知。不过，⼤多数由XRD解析的蛋⽩质结构都介于这两极之间。
上图为不同分辨率下的myoglobin蛋⽩的电⼦云密度图，1.0 Å分辨率下的原⼦位置清晰可辨； 2.0 Å分辨率下虽然每个原⼦的位置已经⽆法清晰辨认，但氨基酸残基整体的形状仍然清晰， 可以⽐较准确地确定原⼦位置；当分辨率来到2.7 Å，氨基酸残基的形状已经变得模糊，准确 推断原⼦位置具有较⼤困难；对于3.0 Å分辨率的结构，⼏乎⽆法从电⼦云密度图辨认出残基 的形状，仅能看到此处有⼀个残基存在。读者可点击此处的链接⾃⾏观察不同分辨率下的电⼦ 云形状：1A6M（1.0 Å）、106M（2.0 Å）、108M（2.7 Å）、1S0H（3.0 Å）。
核磁共振技术
核磁共振技术通过分析蛋⽩质样品中的信号来解析蛋⽩质的结构。需要利⽤特定的同位素标记 ⽅法（如15N或13C标记）将⽬标蛋⽩质中的⼀部分原⼦标记上，再通过2D相关实验（如1H[1]15N HSQC或1H-1H COSY）确定原⼦间的连接关系及三维空间排布。基于实验测得的NMR数 据，使⽤计算⽅法和算法对蛋⽩质的结构进⾏计算和模拟，如分⼦动⼒学模拟、模拟退⽕等得 到蛋⽩质的三维结构模型。
NMR的分辨率通常较低，且⼀般只能⽤来分析较⼩的蛋⽩质⽚段的结构，通过多次采样来得 到溶液中蛋⽩质的平均位置。然⽽，NMR对样品的要求较为灵活，可以提供有关蛋⽩质动态 ⾏为、柔性区域和构象变化的重要信息。
冷冻电⼦显微镜技术
冷冻电⼦显微镜是近年来⾼速发展的技术，通过观察蛋⽩质的冷冻样品中的电⼦显微图像来解析蛋⽩质的结构。Cryo-EM技术不需要蛋⽩质结晶。相反，它使⽤冷冻技术来固定溶液中的蛋⽩质构象，从⽽可以研究⾮晶态或⽆规则结构的蛋⽩质。在过去，Cryo-EM的分辨率不怎么⾼，通常只能达到⼏⼗埃，仅能分辨出蛋⽩质颗粒的⼤致轮廓。2017年的诺⻉尔化学奖授予了Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家，他们三者的⼯作极⼤地提⾼了Cryo-EM技术获得的蛋⽩质图像分辨率。⽬前，Cryo-EM技术获得的蛋⽩结构可达到数埃的分辨率，能够⼤致看出分⼦的轮廓与肽链⾛向。PDB数据库中使⽤Cryo-EM⽅法解析出的分辨率最⾼的蛋⽩质已经具有原⼦级的精度，分辨率达到了1.15 Å（PDBID：7A6A），不过，这些⾼精度的结构仅占极⼩的⽐例，⼤部分结构的精度还处于3-5 Å的中等分辨率下。
由于⽆需结晶，也不⽤解析复杂的核磁共振信号，Cryo-EM在⼤分⼦和超⼤分⼦的结构解析上⾮常有优势，如⼤蛋⽩质复合物、膜蛋⽩和病毒等。此外，Cryo-EM还能够提供动态过程的信息，如蛋⽩质的构象变化。
微晶电⼦衍射技术
除了以上提到的三种技术外，近年来⼀种新的结构解析⽅法——微晶电⼦衍射（Micro-ED）——正⾼速发展起来。该技术可以快速、⾼分辨率的测定⼩分⼦化合物和⽣物⼤分⼦的3D结构。其使⽤电⼦作为⼊射光束，在冷冻透射电镜（cryo-TEM）上获得电⼦衍射数据。由于Micro-ED采⽤电⼦⽽⾮光⼦作为射线，电⼦相⽐光⼦拥有更短的德布罗意波⻓，因此其与物质作⽤的强度更强，能够分析很⼩的晶体并达到很⾼的分辨率。通常Micro-ED只需使⽤约100纳⽶的⼩晶体，在⼏分钟内就能完成数据采集。并且数据采集过程可以直接得到电⼦的相位信息，⽽⽆需进⾏相位重建。数据处理⽅⾯，采⽤常规的XRD解析⼯具就能解析Micro-ED数据，这更近⼀步降低了其应⽤⻔槛。
不过，Micro-ED并不太适合⼤尺⼨蛋⽩的结构解析，其更适⽤于解析短肽以及⼩分⼦化合物。例如天然产物的结构解析或药品⽣产中对API的分析等。⾃2013年应⽤以来，已经有数百篇Micro-ED相关的论⽂发表。
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