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评估ELISA实验数据指标有哪些?

 更新时间:2023-08-09 点击量:561

ELISA实验常用于检测和定量复杂混合物中的特定蛋白质。结果出来后,就需要一定的方法来评估数据是否可靠。主要从以下几个方面进行评估:检测内精度,稀释线性度,回收率,灵敏度(检测限)等。

检测内精度

检测内精度:一般是检测孔板间的重复性。一般用变异系数CV值来评估,变异系数(CV)为标准差σ与平均数µ的比值。每个样品的 %CV 通常应小于 10%,%CV越大代表孔间差异大,重复性不好,结果不可信。

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注:CV较大可由以下原因引起: 移液不准确;在使用前确保枪头在移液器上套牢,确保吸取正确的液体量;试剂溅入其他孔中;样本或试剂受细菌或真菌污染;试剂间交叉污染;酶标板各处温度不一致,确保酶标板在远离气流的恒温环境中孵育;部分孔干透,确保酶标板在孵育过程中始终处于被封盖状态。

稀释线性度

稀释线性度:稀释线性度是指不同稀释水平下测试样品的结果精度。不同稀释倍数下的测量值与精确值的比值应该在70%-130%之间。

在没有基质干扰时,无论如何稀释,测量值都和真实值吻合。而有基质干扰时,样品稀释会导致基质被稀释,会造成非特异性结合比例的减少,测量值也会随稀释倍数的改变而改变。

回收率

回收率:回收率用于确定目标物质检测是否受样品基质差异的影响。例如,待测上清液中所含的大量蛋白质可能会阻碍抗体结合,提高信噪比,从而导致目标物质检测的浓度低于实际值。通过将已知浓度的目标物质加入到不同的样品基质中来确定回收率。如果平均回收率为 80%-120%,则认为样品基质对检测准确定量分析物的能力影响最小。回收率=用基质稀释的目标物质的检测值/用基质稀释的目标物质的确定值*100%。

回收率过高或是过低,则提示实验体系受到较大的复杂基质干扰。比如在空白血清中掺入了 1000 pg/mL 的 IL-2,回收率只有 50%,提示血清中有干扰因素影响了抗体与 IL-2 分子的结合。

灵敏度(检测限)

灵敏度(检测限):灵敏度指可与背景区分的低分析物水平,通常称为分析灵敏度或检测限。一般有三个指标,分别为LOB,LOD,LOQ。

LOB(Limit of blank), 就是我们通常讲的空白检测限。LOB指的是用空白样本去测试,在一定的概率下能测得的最高测量结果。

LOD(Limit of detection), 就是我们通常讲的检测限,就不是用空白样本去检测了,是对低浓度的分析物样本进行测试,在一定的概率的条件下能测得的低值。

LOQ(Limit of quantitation), 就是我们通常讲的定量限,这个也是用低浓度的分析物样本进行测试得出的较低的值,这个值的准确性是有要求的,就是不光要能测到,而且还要保证结果是准确的。

打个比方:比如远处一个物体,随着距离的缩短,你的眼睛从看不见(空白检测限)到能看见(检测限),最后到能确认是什么物体(定量限)。

信噪比

信噪比(Signal/Noise, S/N)就是信号与噪音的比值,也就是样品数据与空白数据的比值。一般以信噪比为 3 : 1 时相应浓度或量确定检测限, 10:1时的量为定量限。

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