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琼脂糖核酸电泳介绍

 更新时间:2023-11-21 点击量:214

琼脂糖核酸电泳步骤

1.    用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净, 放在制胶平板上, 封闭模具边缘, 架好梳子;

2.    根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确 称量琼脂糖干粉, 加入到配胶用的三角烧瓶内, 定量加入电泳缓冲液(一般

20~30 ml);

3.    放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻, 加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分

混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;

4.    室温下 30~45 分钟后凝胶全凝结, 小心拔出梳子, 将凝胶安放在电泳槽内;

5.    向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面 1mm 为宜,如样品孔内有气

泡,应设法除去;

6.    在 DNA 样品中加入 10×体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪

将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;

7.    接通电源, 红色为正极,黑色为负极, 切记 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠

近加样孔的一端为负)。一般 60 ~ 100V 电压,电泳 20 ~ 40min 即可;

8.    根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;

9.    电泳完毕, 关上电源, 在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子

量标准 Marker 比较被扩增产物的大小。

琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围

琼脂糖凝胶浓度

线形 DNA 的最佳分辨范围(bp

0.5%

1,000  30,000

0.7%

800  12,000

1.0%

500  10,000

1.2%

400  7,000

1.5%

200  3,000

2.0%

50  2,000

 

胶回收纯化 DNA

1.   琼脂糖电泳,将特异电泳带用刀切下放入到 EP 管中,称琼脂糖带的重量;

2.   按照每 100mg  400µl 的量加入binding buffer,放入到 EP 管振荡器中,45 ~

55温育振荡,直到所有的琼脂糖都溶解(大概要 5 分钟 );

3.   取出纯化柱, 将上述溶解液转移至柱中, 室温下放置 2 分钟, 8,000rpm   离心

1 分钟,弃 EP 管中的液体,将纯化柱放回 EP 管中;

4.    500µl  wash buffer 至柱中, 8,000rpm   离心 1 分钟。弃管中的溶液;

5.   重复操作 4 步的操作 1 次,最后将纯化柱放入 EP 管中 10,000rpm  离心 30 秒,

除去痕量的 wash buffer

6.   将纯化柱放入一个新的 EP 管。加 30~40µl H2O 或者 elution buffer 至纯化柱膜 的中央,在37 50下放置 2 分钟, 10,000rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA,将

EP 管中的 DNA 溶液放在-20保存。

7.   注: 若想要不电泳而直接纯化 DNA 溶液, 只需要在第 2 中按 100µl 液量加 400µl  binding buffer,其余的步骤不变。