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细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤

 更新时间:2023-11-22 点击量:661

细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤:

1、细胞DNA 含量分布( 由细胞DNA 降解方式检测细胞凋亡) 

    收集已固定的单细胞悬液约 5× 105~1 × 106/ml;

    离心除去固定液, 3ml PBS 重悬细胞;

   使用低速离心机 1500rpm  离心, 5 分钟 ,弃去 PBS;

   加 PI 染液 1ml,室温避光 20 分钟;

   调整细胞浓度 5× 105/ml;

   上机检测。

细胞凋亡检测试剂盒.jpg

2 、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1)      常 规 制 备 单 细 胞 悬 液 ,  用 PBS   洗 两 次 .(  若 为 全 血 要 先 溶  血),取约 5× 106 个细胞,1500rpm 离心,弃上清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重悬;

2)   分成 a 、b 、c 、d 、e 五管,每管约 1× 106 个细胞

a)    阴性对照,不加任何试剂;

b)    阳性对照,加 2%多聚甲醛固定 30 分钟,加 AnnexinV 5μl, 室温 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗一次,弃上清再加 190μl  缓冲液、10μl PI 避光 15 分钟

c)    加 10μl PI,避光孵育 15 分钟;

d)   加 5μl AnnexinV 液,室温避光孵育 15min;

e)    加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液,室温避光孵育 5min;

3)   每管各加 400μl 1 ×Binding Buffer。

4)   上机检测。

注意 a.  操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞;

b.  操作时注意避光;

c.  反应完毕后尽快检测,最好在一小时内检测。

3、用单克隆抗体 APO2.7 检测细胞凋亡

1)   放置 0.5~1× 106 个细胞到试管中;

2)    室温离心 200g ,6min;

3)    弃上清 ,加入 100μl 冷的(4℃ )在 PBSF 溶液中含 100µg/ml  的 digitonnin,轻轻地重悬细胞,在冰上孵育 20min;

4)   加入 2ml 冷的(4℃) PBSF 液,室温离心 200g ,6min;

5)    弃上清, 加入 20μl PE 标记的 Apo2.7  单克隆抗体和 80μl PBSF 液,用 vortex 轻轻震荡,室温避光孵育 15 分钟;

6)   加入 2ml PBSF 液,室温离心 200g ,6min;

7)    弃上清,加入 1ml PBSF 液重悬细胞;

8)   避光保存,直到流式细胞仪检测。

PBSF:含 2.5% FCS(v/v)和 0.01%NaN3(w/v)的 PBS。

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