细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤:
1、细胞DNA 含量分布( 由细胞DNA 降解方式检测细胞凋亡)
收集已固定的单细胞悬液约 5× 105~1 × 106/ml;
离心除去固定液, 3ml PBS 重悬细胞;
使用低速离心机 1500rpm 离心, 5 分钟 ,弃去 PBS;
加 PI 染液 1ml,室温避光 20 分钟;
调整细胞浓度 5× 105/ml;
上机检测。
1) 常 规 制 备 单 细 胞 悬 液 , 用 PBS 洗 两 次 .( 若 为 全 血 要 先 溶 血),取约 5× 106 个细胞,1500rpm 离心,弃上清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重悬;
2) 分成 a 、b 、c 、d 、e 五管,每管约 1× 106 个细胞
a) 阴性对照,不加任何试剂;
b) 阳性对照,加 2%多聚甲醛固定 30 分钟,加 AnnexinV 5μl, 室温 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗一次,弃上清再加 190μl 缓冲液、10μl PI 避光 15 分钟
c) 加 10μl PI,避光孵育 15 分钟;
d) 加 5μl AnnexinV 液,室温避光孵育 15min;
e) 加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液,室温避光孵育 5min;
3) 每管各加 400μl 1 ×Binding Buffer。
注意 a. 操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞;
b. 操作时注意避光;
c. 反应完毕后尽快检测,最好在一小时内检测。
1) 放置 0.5~1× 106 个细胞到试管中;
2) 室温离心 200g ,6min;
3) 弃上清 ,加入 100μl 冷的(4℃ )在 PBSF 溶液中含 100µg/ml 的 digitonnin,轻轻地重悬细胞,在冰上孵育 20min;
4) 加入 2ml 冷的(4℃) PBSF 液,室温离心 200g ,6min;
5) 弃上清, 加入 20μl PE 标记的 Apo2.7 单克隆抗体和 80μl PBSF 液,用 vortex 轻轻震荡,室温避光孵育 15 分钟;
6) 加入 2ml PBSF 液,室温离心 200g ,6min;
7) 弃上清,加入 1ml PBSF 液重悬细胞;
8) 避光保存,直到流式细胞仪检测。
PBSF:含 2.5% FCS(v/v)和 0.01%NaN3(w/v)的 PBS。
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