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免疫荧光标记法

 更新时间:2023-11-22 点击量:449

免疫荧光标记法

1、细胞膜上的免疫荧光检测法

间接标记法

1)    制备单细胞悬液;

2)    细胞计数,取出  106 个细胞于试管中;

3)   用台盼蓝染色计活细胞数,要求活细胞数 >90  95%

4)   在试管中加入一抗,(剂量按照说明书的要求),孵育 30  60 分钟;

5)    PBS 洗涤 1  2 次, 1500rpm,离心 3 分钟,弃上清;

6)   加入二抗,孵育 20  30 分钟;

7)   PBS 洗一次, 1500rpm,离心 3 分钟,弃上清;

8)    300μl PBS,上机检测(若不能及时上机检测, 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定,可放置 1 )

直接标记法

 ~ 同间接标记法

在试管中加入荧光标记的抗体,混匀,孵育 30 分钟;

 PBS  2 次, 1500rpm,离心 3 钟,弃上清;

 300μl PBS(PH=7.4),上机检测。

2 细胞膜内的免疫荧光标记法

间接免疫荧光标记法

1)   取已制备好的单细胞悬液,用 1  3%的多聚甲醛固定 30 分钟(也可 4 保存过夜 );

2)     PBS 洗两次,弃上清;

3)    细胞膜打孔,加入 0.1%皂素 200μl,室温 10 分钟;

4)     PBS 洗涤两次;

5)   加入第一抗体, 室温 30  60 分钟, 4过夜, 同时须设阴性对照或同 型对照管;

6)     PBS 洗涤两次;

7)   加入二抗(荧光标记的抗体)室温 20 分钟,避光;

8)     PBS 洗涤 1  2 次,弃上清;


9)    重悬细胞于 500μlPBS 中,上机检测。

直接荧光标记法

 ~ 同间接荧光标记法;

加入荧光素标记好的抗体,避光 30 分钟(同时做同型对照管);

 PBS 洗涤1~2次,弃上清;

 300μl PBS 上机检测。

细胞膜上及细胞内双标记法( 直标法)

1)   取出已制备好的未固定的单细胞悬液  10 6 个细胞于试管中; 2)     PBS 洗涤两次;

3)   加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原, 同时加上阴性对照管, 室温孵育 20 分钟;

4)   在试管中加入 1%~3%多聚甲醛 1ml,固定 30 分钟;

5)   PBS 洗涤两次 1500rpm 3 分钟,弃上清;

6)   打孔,加入 0.1%皂素 200μl 室温 10 分钟;

7)    PBS 洗涤两次,弃上清;

8)   加入用荧光素标记的抗体,标记膜内的抗原(标记膜内的抗体的荧光素

的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同)室温 20 分钟孵育;

9)     PBS 洗一遍弃上清;

10)  300μlPBS 重悬细胞,上机检测

五、流式细胞术中的几点注意事项:

1 、对照组的设置:

在流式细胞术中所测得的量都是相对值,不是绝对值。如需知道绝对值

时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。

 1 )、阴性对照的设置

² 在实验过程中,如做间接标记法,可设置与一抗无关的实验,即在 实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照

管,作为阴性对照。

² 在实验过程中,假设做直接标记法,可设置理论上的阴性细胞作为  阴性对照管, 实验过程及步骤与实验组务必相同。(做间接标记法时 

同样也可同时设置 阴性细胞" 的阴性对照管作为阴性对照。

² 在实验过程中,假设做直接标记法,可将实验组细胞,取一管,加

上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。 

2)、阳性对照的设置:

在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验,应设置阳性对照组,其设置方法与阴性对照设置相同。

2、几点建议:

1)   在实验过程中, 在保证实验的科学性和准确性的基础上, 应尽量减少实验工 序和过程。由于间接标记法的工序多,实验过程长, 如再加之操作的不熟练  细胞更容易丢失和受损, 而造成实验结果的误差。因此,在条件允许的范围 内, 建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法, 以保证实验的真实性和准 确性。

2)    建议送检细胞一定要足够量, 一般要求  106 个细胞。不要过少。因为,如 细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数, 结果也不可信。  胞量也不宜过多, 因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足, 结果也由此受

影响。

3) 同一种细胞需同时做双标记时, 须做双标记的同型对照 且两种抗体所标记 的荧光颜色务必不同。