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双向电泳的样品的制备及电泳实验步骤

 更新时间:2023-11-23 点击量:228


样品制备原则

样品制备是双向电泳中最关键的一步,将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并 没有一个通用的样品制备方法, 尽管处理方法多种多样, 但都遵循几个基本的原 则: 1)尽可能的提高样品蛋白的溶解度,抽提最大量的总蛋白,减少蛋白质的 损失; 2)减少对蛋白质的人为修饰; 3)破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作

用,并使蛋白质处于变性状态。

根据这一原则,样品制备需要四种主要的试剂:离液剂(chaotropes), 主要包 括尿素(Urea)和硫脲(thiourea );表面活性剂(sufactants),也称去垢剂,

如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂;还原剂(reducing agents),常用的是二硫苏糖醇(DTT)和磷酸三丁酯(TBP)等。当然,也可以选择性 的加入 Tris-base, 蛋白酶抑制剂以及核酸酶。样品的来源不同,其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合, 以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中, 必须考虑到去除 影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质,比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐  类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径,盐浓度过高会降低等电聚焦的电压, 甚至会损坏 IPG 胶条,这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后

续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理, 超声处理应控制好条件, 并防止产生 泡沫; 而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过 超速离心除去。透析可以降低盐浓度, 但时间太长; 也可以采取凝胶过滤或沉淀 /重悬法脱盐,但会造成蛋白质的部分损失。

因此, 样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求 来进行选择。 目前有很多方法适于 2-DE,如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细 胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白(如磷酸化蛋白、 采用 亲合纯化凝集素结合蛋白等)。

一、细胞样品

1.    细胞培养,加药与处理。

2.    胰酶消化贴壁细胞, PBS 漂洗 3 次(1500g, 5min) ,弃上清,  再次离心,去 尽残液( 非常重要!)。如要比较细胞膜蛋白组的差别, 最好用细胞刮收获细 胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS,可有效降低样品的 盐浓度。加入 5 倍体积裂解液,混匀(或将 1× 106  细胞悬于 60 ~ 100µl 裂解液 中 )。 

3.    加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ,在 4℃放置 15 分钟。

4.    15,000 转, 4℃离心 60 分钟(或 40,000 转, 4℃离心 30 分钟 )。 

5.    收集上清。

6.    测定蛋白浓度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit)。

7.    分装样品,冻存于-70℃。

二、组织样品

1.   碾钵碾磨组织,碾至粉末状。

2.   将适量粉末状组织转移至匀浆器,加入适量裂解液,进行匀浆。

3.   加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase,在 4℃放置 15 分钟。

4.   15,000 转, 4℃离心 60 分钟(或 40,000 转, 4℃离心 30 分钟 )。 

5.   收集上清,测定蛋白浓度。

6.    分装样品,冻存于-70℃。

注意事项:

1.   8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用,否則 PMSF 会失去活性。 

2.  40 mmol/L 浓度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3.   细胞清洗―― 大多用 PBS,若 PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹 ,

则可利用(10 mmol/LTris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。 

电泳示意图.jpg

双向电泳操作步骤

水化上样(被动上样)

1.    从冰箱中取出 IPG 胶条,室温放置 10min。

2.    沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品,槽两端各 1cm 左右不加样,中间 的样品液一定要连贯.注意:不要产生气泡, 否则会影响胶条中蛋白质的分布。

3.    用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的保护层。 注意:碱性端较脆弱,应小心操作。

4.    将IPG 胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上.注意:不要将样品溶液弄到 胶条背面, 因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产 生了气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶走。

5.    放置 30~45min 大部分样品被胶条吸收, 沿着胶条缓慢加入矿物油, 每根胶条

约 3ml(17cm IPG),防止胶条水化过程中液体蒸发。

6.    置等电聚焦仪于-20℃水化 11~15h。

一向 等电聚焦

1.    将纸电极置于聚焦盘的正负极上,加 ddH2O 5~8µl 润湿。

2.    取出水化好的胶条,提起一端将矿物油沥干,胶面朝下,将其置于刚好润湿 的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

凝胶电泳.png

3.    将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中, 胶条的正极(标有+ )对应于聚焦盘的正极,确保胶条与电极紧密接触。

4.    在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油。

5.    对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。

6.    聚焦结束的胶条,立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳。或将胶条置于样

品水化盘中, -20℃冰箱保存, 电泳前取出胶条, 室温放置 10 分钟, 使其溶解。

第二向 SDS-PAGE 电泳

1.    配制 12%的丙烯酰胺凝胶。

2.    待凝胶凝固后, 倒去分离胶表面的 MilliQ  水、乙醇或水饱和正丁醇, 用MilliQ 水冲洗。

3.    配制胶条平衡缓冲液 I

4.    在桌上先放置干的厚滤纸, 聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用 MilliQ 水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品,这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

5.    将胶条转移至样品水化盘中,加入 6ml(17cm IPG)平衡缓冲液 I,在水平摇床 上缓慢摇晃 15 分钟。

6.    配制胶条平衡缓冲液 II。

7.    第一次平衡结束后,取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体,放入平衡缓 冲液 II 中,继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

8.    用滤纸吸去 SDS-PAGE 胶上方玻璃板间多余的液体, 将二向凝胶放在桌面上,

凝胶的顶部面对自己。

9.    将琼脂糖封胶液加热溶解。

10.  在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。

11.  第二次平衡结束后,取出胶条,用滤纸吸去多余的平衡液(将胶条竖在滤纸 上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

12.  用镊子夹住胶条的一端使胶面全浸末在 1× 电泳缓冲液中漂洗数次。

13.  将胶条背面朝向玻璃板,轻轻放在长玻板上,加入低熔点琼脂糖封胶液。

14.  用适当厚度的胶片, 轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面全接 触.注意:不要在胶条下方产生气泡, 应推动凝胶背面的支撑膜, 不要碰到胶面。

15.  放置 5 分钟,使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

16.  打开二向电泳制冷仪,调温度为 15℃。

17.  将凝胶转移至电泳槽中,加入电泳缓冲液,接通电源,起始时用的低电流 (5mA~10mA/gel/17cm ),待样品在全走出 IPG 胶条, 浓缩成一条线后, 再 加 大 电流(20-30mA/gel/17cm )待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

 18.  电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。

19.  进行染色。

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