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SDS-PAGE 胶染色介绍

 更新时间:2023-11-23 点击量:236

 

一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较

 

染色.png

 

 

二、考马斯亮蓝染色

CBB 染色液

0.5%考马斯亮蓝 G250 或 R250

40%甲醇

10%乙酸

将 CBB 溶于甲醇中并不停的搅拌 15min。加入乙酸与 ddH2O 脱色液: 30%甲醇

10%乙酸

染色方法: 1.在摇床上染色 30min.

2.脱色至蛋白点或条带清晰可见

3. ddH2O 洗 3-5 次

三、胶体考马氏亮蓝染 色 Colloidal Coomassie Staining( Cambridge centre for porteomics )

sensitivity = ~100ng

1.  固定:甲醇/醋酸/H2 O(45:1:54) 至少 20min.

2.  染色 12-18hr。

染色液:   17% (w/v)  硫酸铵

34%甲醇

0.5%醋酸

0.1% (w/v) Coomassie G250

3.  脱色:用 H2O 脱色至蛋白点和背景清晰.

双向电泳蛋白点的切取和保存

1.   用 PDQuest 软件或肉眼比对,找出感兴趣的蛋白点,并做好标记和记录。

2.   用 MilliQ  水冲洗胶 2 次。

3.   用色谱纯甲醇和 MilliQ  水冲洗 Ep 管

4.   将枪头(200µl)下端剪去,使其内径略小于蛋白斑点的直径,用色谱纯甲醇和 MilliQ 水冲洗枪头。

5.   对准斑点中央小心将蛋白切割下来, 放入 Ep 管,MilliQ 水漂洗 2 次, 如胶块 太大,将其切成 1 x 1 mm 的胶片。

6.   将切好的点做好标记和记录,置-80oC 保存或冻干后-20oC 存放。

注意事项:

1.   尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染,在操作过程中应戴一次性的 PE 手套 (不用乳胶手套)和帽子。

2.   不要将胶长期存放于乙酸溶液中。

3.   Ep 管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗, 尤其应与进行 Western blotting 的容器分开,以避免 casein 或 BSA 的污染。