PCR标准操作流程详解
一、概述
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种在体外合成双链DNA的技术。其原理模仿了天然DNA的复制过程,通过特异引物和高特异性酶,确保反应的特异性。典型的PCR反应包括三个步骤:变性、退火和延伸,通过多次循环,最终获得目标DNA片段。
二、试剂准备
以下为进行PCR反应所需的试剂及其终浓度:
试剂 终浓度 | PCR buffer 1x |
dNTPs <0.4mM | Forward primer <0.4uM |
Reverse primer <0.4uM | Template DNA <100ng |
热启动酶 5U | ddH2O Up to 50 ul |
三、操作步骤
1. 配置反应体系
将以下成分按顺序加入0.5ml的离心管中:
l 加入PCR buffer。
l 加入dNTPs。
l 加入Forward primer。
l 加入Reverse primer。
l 加入Template DNA。
l 加入热启动酶。
l 用ddH2O补至总体积50 ul。
注意:使用热启动酶时,可在常温下操作;非热启动型酶需在低温下配置反应体系。
2. 设置反应条件
根据试剂盒说明书设置反应时间和温度,完成扩增后进行电泳鉴定。
3. 琼脂糖核酸电泳
① 准备电泳器具,用蒸馏水洗净并架好梳子。
② 根据所需分离的DNA片段大小,制备适当浓度的琼脂糖凝胶。
③ 将琼脂糖和电泳缓冲液(TAE或TBE)加入锥形瓶中,加热融化后冷却至40℃左右,混匀并倒入电泳槽。
④ 室温下凝固凝胶,拔出梳子,准备点样。
⑤ 在电泳槽中加入电泳缓冲液,确保覆盖凝胶表面。
⑥ 混合5ul样品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料,缓缓注入点样孔,避免串孔。
⑦ 接通电源(红正黑负),设置电压40-60V,电泳时间30-40min,根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。
⑧ 电泳结束后,关闭电源,进行凝胶成像观察,并对比marker确定片段大小。
不同琼脂糖浓度对应的DNA片段大小如下表:
琼脂糖浓度/% DNA 大小 /kb | 0.3 5-60 |
0.5 1-30 | 0.7 0.8-12 |
1.0 0.5-10 | 1.2 0.4-7 |
1.5 0.2-3 | 2.0 0.05-2 |
四、注意事项
引物设计
Ø 引物应设计在cDNA的保守区域。
Ø 引物长度应在15-28bp之间。
Ø GC含量应在40%-60%之间。
Ø 避免引物自身形成发夹结构,完成后进行BLAST验证。
模板DNA
Ø 模板可以是单链或双链DNA。
Ø 不同来源的模板起始浓度有一定要求。
Ø 模板提取后应注意保存,避免降解。
其他
Ø 选择合适的Taq DNA聚合酶。
Ø 确保四种dNTP浓度相同。
Ø 操作过程中戴手套,保持环境干净,防止污染。
Ø PCR用水需经过高压灭菌或0.2um滤膜过滤。
五、常用试剂配方
电泳缓冲液
50xTAE(pH8.5)
Tris 242g
EDTA(Na)37.2g
Ø 加入800ml去离子水,搅拌溶解
Ø 加入57.1ml乙酸,调pH至8.5后定容至1L
10xTBE(pH8.3)
Tris 108g
EDTA 7.44g
硼酸55g
Ø 加入800ml去离子水,搅拌溶解,调pH至8.3后定容至1L
上样缓冲液(6xLoding buffer)
0.25%二甲苯青
0.25%溴酚蓝
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