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实时荧光定量PCR技术介绍

 更新时间:2024-08-09 点击量:234

实时荧光定量PCR(qPCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,它的出现解决了传统PCR不能对初始模板定量分析的问题。荧光定量PCR具有准确性高、灵敏度高、特异性强等优点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

荧光定量PCR步骤

荧光定量PCR原理

PCR反应体系中加入荧光基团,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,末了得到一条荧光扩增曲线图,扩增曲线横坐标表示循环数,纵坐标表示荧光强度。


PCR荧光2


荧光定量PCR常用术语


  1. 基线:实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为3-15个循环)的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小。

  2. 荧光阈值:荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,一般荧光阈值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

  3. Ct值:Ct值指的是PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数。

  4. 标准曲线:标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。对已知拷贝数的标准样品做系列稀释,对不同稀释度的标准样品进行荧光定量PCR并记录Ct值,根据Ct值及拷贝数的对数绘制得到标准曲线,标准曲线的纵坐标代表起始拷贝数的对数,横坐标代Ct值。

  5. 实现对初始模板的定量

  6. 利用实时荧光定量 PCR对样品的初始模板量进行定量分析,需要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线,再通过荧光定量PCR获得未知样品的Ct值,最后从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

  7. 标准曲线绘制

  8. 标准品的制备:设计特定引物,利用PCR对目的基因片段进行扩增,随后将目的基因片段克隆至载体中,测序验证是否为阳性重组质粒,最后收集阳性克隆质粒作为标准品。

  9. 绘制标准曲线:测定质粒的浓度,依据公式计算出质粒的拷贝数。对质粒进行系列稀释,分别作为模板进行荧光定量PCR并记录Ct值。最后依据起始拷贝数的对数及Ct值绘制标准曲线,得到标准方程。当需要对起始模板进行定量时,只需要得到扩增曲线,读得Ct值,带入标准方程即可对起始模板定量。

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荧光标记方法

荧光定量PCR荧光标记方法可分为荧光染料法和荧光探针法两类。


  • 荧光染料:染料法是利用荧光染料可以嵌合到DNA双链内部的特性,来指示扩增产物的增加。

  • 荧光探针:探针为一段寡核苷酸,可与DNA序列特异性结合,一个模板结合一个探针。探针5’端具有报告基团(R),可发光;3’端有荧光淬灭基团(Q),能吸收光。探针完整时R基团所发射的荧光能量被Q基团吸收,PCR仪检测不到荧光信号。随着扩增的进行,探针会被聚合酶水解,报告基团发出的光没有被淬灭基团吸收,从而被仪器检测到。


荧光探针与染料法对比

探针法:特异性高、重复性好,但只适合一个特定的目标,探针价格较高。

染料法:对DNA模板没有选择性,适用于任何DNA,使用方便,成本低,但容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性。


朗基PCR


荧光定量PCR应用

  实时荧光PCR技术已广泛应用于医学及生命科学研究的各个领域中。在科研方面可定量分析各种基因的表达分析,基因突变和多态性分析,单核苷酸多态SNP测定及易位基因的检测;在医学方面可用于免疫组化分析、早期筛查、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微小残留病变研究等。

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