分子生物学试剂在基因测序技术中扮演着至关重要的角色，其核心作用贯穿了从样本处理、文库构建到测序反应的全过程。
1.样本处理与核酸提取
（1）裂解与纯化
裂解试剂：
化学裂解液（如胍盐、表面活性剂）：破坏细胞膜和核膜，释放核酸。
酶解法（如蛋白酶K、溶菌酶）：降解与核酸结合的蛋白质（如组蛋白）。
物理辅助（如珠磨法、超声破碎）：通过机械力加速细胞裂解。
纯化试剂：
硅膜吸附柱：利用硅胶膜特异性吸附DNA/RNA，去除杂质（如蛋白质、多糖、抑制剂）。
磁珠法：磁性纳米颗粒结合核酸，通过磁性分离快速纯化。
缓冲液系统（如高盐低pH）：优化核酸与杂质的结合差异，提升纯度。
（2）核心作用
确保核酸的完整性（避免断裂）和高纯度（去除PCR抑制剂），为后续步骤提供高质量模板。
2.文库构建（LibraryPreparation）
（1）核酸片段化
酶法片段化：
DNaseI：随机切割DNA链，产生平末端或粘性末端。
转座酶（Tagmentation）：同时完成片段化和接头添加（如Nextera技术）。
超声片段化：
超声波将DNA打断为特定长度片段（如100~500bp），需配合稳定剂（如Covaris试剂盒）。
（2）接头连接与修饰
接头（Adapter）：
包含测序引物结合位点、索引序列（Index）和标签序列，用于区分不同样本。
T4DNA连接酶：催化DNA片段与接头的共价连接。
末端修复：
Taq聚合酶：填补5'端突出末端，生成钝末端。
Klenow酶：修复3'端凹槽并加dA尾（与TruSeq接头匹配）。
磷酸化与连接效率增强剂：
ATP和T4PNK酶：对接头进行5'磷酸化，提高连接稳定性。
（3）核心作用
确保文库的均一性（片段长度一致）和特异性（接头正确连接），避免测序偏差。
3.分子生物学试剂测序反应中的试剂
（1）PCR扩增与富集
PCR试剂：
HotStartTaq酶：减少非特异性扩增，提高文库富集效率。
dNTPs：提供DNA合成原料，需平衡浓度以避免错误掺入。
Mg??/DMSO：优化PCR反应体系的离子强度和变性温度。
目的：通过有限循环PCR（如10~15次）放大文库，避免过度扩增导致偏好性。
（2）测序模板制备
单分子模板制备：
乳液PCR（emulsionPCR）：用于454焦磷酸测序，通过微珠包裹单个DNA片段进行扩增。
桥式PCR（BridgePCR）：在FlowCell表面生成DNA簇（如Illumina技术）。
核心试剂：
Phi29聚合酶：用于多重置换扩增（MDA），生成滚动环状DNA（RDA）。
（3）测序反应体系
荧光标记与终止剂：
ddNTPs（双脱氧核苷酸）：用于Sanger测序，终止链延伸并标记荧光。
可逆终止剂：Illumina边合成边测序（SBS）中使用，暂时阻断链延伸后化学去除。
聚合酶与底物：
DNA聚合酶：催化核苷酸掺入（如Illumina的高性能酶减少错误率）。
引物与模板结合缓冲液：维持测序反应的高特异性。
更新时间：2025-07-18
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