荧光定量 PCR（qPCR）实验技巧：提高 PCR 特异性的 9 种方法

实时荧光定量 PCR（qPCR）是生命科学领域的革命性技术，能在 PCR 扩增过程中实时监测荧光信号，实现对靶基因的精确定量。荧光定量 PCR 已成为分子生物学领域的金标准技术，但其特异性优化仍是许多研究者面临的挑战。

然而，PCR 特异性问题始终困扰着许多研究人员。非特异性扩增不仅会导致实验结果不准确，还会浪费宝贵的样本和时间。本文将详细介绍提高 PCR 特异性的九大方法，并结合最新市场数据，帮助您选择适合的荧光定量 PCR 仪器和试剂。

一、引物设计：特异性扩增的基石

细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。

引物设计的关键原则

• 长度适宜：典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列特性，但大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。

• GC 含量合理：选择 GC 含量为 40％到 60％或 GC 含量映像模板 GC 含量的引物。设计 5' 端和中间区为 G 或 C 的引物，增加引物稳定性。

• 避免二聚体：避免引物对 3' 末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

• 3' 末端设计：避免 3' 末端富含 GC，保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。避免 3' 末端的错误配对。

• 二级结构：避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

使用 NCBI Primer-BLAST 工具进行引物设计，注意跨外显子连接区设计，避免基因组 DNA 扩增。

二、引物退火温度：精确控制的关键

熔解温度（Tm）是当 50％的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。

优化策略

• 合理的退火温度从 55℃到 70℃，一般设定比引物的 Tm 低 5℃。

• 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值（差异不超过 5℃）。

• 可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性，以 2℃为增量逐步提高退火温度。

三、递减 PCR：逐步提高特异性的方法

递减 PCR 通过在 PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环开始在比估算的 Tm 高大约 5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低 1℃到 2℃，直到退火温度低于 Tm 5℃。

这种方法只有同源性最高的目的模板会被扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。

四、引物浓度：平衡产量与特异性

引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.1 到 0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

可以使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过 Beers 法则计算引物浓度。避免使用寡聚核苷酸作为标准在 EB 染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。

五、引物纯度和稳定性：保证实验结果的一致性

定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。但部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。

引物保存建议

• 最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100μM。

• 将干粉和溶解的引物储存在 - 20℃。

• 大于 10μM 浓度溶于 TE 的引物在 - 20℃可以稳定保存 6 个月。

• 干粉引物可以在 - 20℃保存至少 1 年。

六、热启动 PCR：有效防止非特异性扩增

热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性，因此在进行 PCR 反应配制过程中会产生非特异性的产物。

Platinum Taq DNA 聚合酶对于自动热启动 PCR 来说方便高效。同经化学修饰用于热启动的 Taq DNA 聚合酶相比，Platinum 酶不需要在 94℃延时保温（10 到 15 分钟）以激活聚合酶。

七、镁离子浓度：影响 PCR 多个方面

镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。包含 200μM dNTP 的典型 PCR 起始浓度是 1.5mM（对实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液）。

为了确定最佳浓度，从 1mM 到 3mM，以 0.5mM 递增，进行镁离子滴定。Platinum Taq DNA 聚合酶能够在比 Taq DNA 聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。

八、PCR 添加剂：增强困难模板的扩增

对于高 GC 含量的模板等困难模板，需要添加辅助物质。PCR 添加剂包括甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱以及 PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增。

它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制 Taq DNA 聚合酶的 DMSO、甲酰胺和甘油。

九、巢式 PCR：大幅提高特异性和灵敏度

使用巢式引物进行连续多轮扩增可以显著提高特异性和灵敏度。第一轮是 15 到 20 个循环的标准扩增，将一小部分起始扩增产物稀释 100 到 1000 倍加入到第二轮扩增中进行 15 到 20 个循环。

在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式 PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。

荧光定量 PCR 仪器选择指南

实验质量控制要点

为确保 qPCR 实验结果可靠性，必须设置以下五种必要对照：

• NTC（无模板对照）：监测引物二聚体 / 体系污染。

• NRT（无逆转录对照）：检测 gDNA 残留。

• 阳性对照：确认反应体系有效性。

• 标准曲线：计算引物扩增效率。

• 内参对照：样本间归一化基准。

提高 PCR 特异性需要综合考虑引物设计、反应条件优化和添加剂使用等多个方面。通过本文介绍的九种方法，您可以显著提高 PCR 反应的特异性，获得更加可靠实验结果。

同时，选择高质量的 PCR 仪器和试剂也是确保实验结果重复性的重要因素。根据您的实验需求和预算，选择适合的荧光定量 PCR 仪，将有助于您获得更加准确和可靠的实验结果。