PCR 产物纯化方法（酚/氯仿）:
1. 取 PCR 产物（此次为 200 ul），加入 50 ul 酚，加入 50 ul 氯仿/异戊醇（分相上层应该是澄清的，如果不是澄
清，可以再次离心 5 min，将澄清上清取出）；
2. 剧烈振荡（100 bp 的小片断没有必要剧烈振荡），混匀后，离心 6000－8000 转（一般大片断离心 10000 rpm），
5 min。（只能离心 5 min，过久的话就会酚变成沉淀）；
3. 取上请，不要吸到中间箱，吸取后再在弃液中加入双蒸水，再次离心，收集上清，反复两次；
4. 上请 2 倍体积的 100％乙醇以及 0.2 倍体积的 NaAc 沉淀，-20oC（1 h 也可以）过夜沉淀（异丙醇效果更好，
但是不纯）；
5. 12000 转，离心 20min，弃去上请。70％乙醇清洗一次，离心，12000 rpm，10 min，重复洗涤 1－2 次（多
洗几次除去酚杂质）；
6. 弃去乙醇，充分晾干，双蒸水融解。
2.13. 大肠杆菌菌落 PCR
1．取适量 PCR 薄壁管，置于冰上，每管先加入 17.3ul 的灭菌水。
2．用灭过菌的 10ul 小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。
3．依次加入：
10xBuffer 2.5
MgCl2（25mM） 1.8
DNTP（2.5mM） 1
T3 引物（10pmol） 1
T7 引物（10pmol） 1 33
Taq 酶 0.4
Total 25ul
各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于 PCR 仪上
4． 94℃ 2 min
94℃ 4 min
94℃ 40 s
53.6℃ 40 s，35 个循环
72℃ 4 min
72℃ 10 min
4℃ 24 h
5．待 PCR 反应进入 4℃后，取下 PCR 薄壁管，取 7ulPCR 产物加入 3ul 溴芬兰跑电泳，同时上 1Kb DNA ladder。
半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
6．将快速鉴定和菌落 PCR 检测合格的文库送检。不必要额外煮沸。只需要挑取少许克隆，在配好的 PCR 反应
液中涮几下，然后用正常的 PCR 反应程序即可。因为在 PCR 第一个循环 94°变性的步骤中（正常设置为 4-5min 即
可），质粒或基因组肯定有释放，也足够 PCR 反应的模板用量了，这个我每天都在做，还没有做不出的时候。
只需要挑取少许克隆，在配好的 PCR 反应液中涮几下，然后用正常的 PCR 反应程序即可。因为在 PCR 第一个
循环 94°C 变性的步骤中（正常设置为 4-5min 即可），质粒或基因组肯定有释放，也足够 PCR 反应的模板用量了，
这个我每天都在做，还没有做不出的时候。
补充几点如下：
1. 沾有菌落的牙签在 PCR 反应液中涮过之后，还可以直接扔到 LB 培养基中用来接种（问题不大，重组质粒一般都
含抗性的）。
2. 在做菌落 PCR 的时候，每次都要做阴性、阳性对照，阳性对照可以用抽提好的质粒或基因组，这样可以确定 PCR
主反应液的配制没有问题，不会因为菌落 PCR 阴性而怀疑 PCR 的反应；阴性对照加一点水或者什么都不加，这样可
以帮助识别 PCR 反应是否有假阳性产生的可能；如果偷懒的话，阴性对照可以不做，但阳性对照则是必须要做的。
3. 再告诉大家一个偷懒的菌落 PCR 鉴定的方法：按照每次反应 15-20 ul 的体系计算好 PCR 各反应组分的量/次，
然后一次性配制 100 次或 50 次反应的量，做成 Ready-to-use 的 PCR 主反应液（除 Primers、Taq 酶不加，模板
用的是菌落），每次做菌落 PCR 的时候，只需要根据反应的个数，吸取相应的 PCR 主反应液，补加相应的 Primers、
Taq 酶，再分装即可。这样的好处有二：即开即用，节省时间；另外反应组分均一，可减少实验批次之间的误差。
用枪头挑取半个菌落，加入 MIX(除了模板其他的都有），平板放入培养箱继续培养。等 PCR 结果出来了，直接
挑取阳性克隆摇菌。
还可以采用菌落裂解电泳的方法直接挑取重组子。一般目的片段如果不是很小，空载体和重组载体比较容易区分的
话，都可以采用这种方法。 将菌落培养时间稍微延长，挑取半个菌落加入裂解液中，同时挑取蓝斑（如非兰白斑，
直接取空载体质粒）作为对照，电泳即可区分。 这个方法有现成的试剂盒，也可以自己配制。
菌落 PCR：我的做法是用枪头挑菌落，在分装好的 pcr 反应体系（除了 Taq 酶）中吸几下，然后在 100 度 5 分钟裂
解后加入 Taq 酶，然后就可以进行 pcr 循环了。
更新时间：2025-09-12
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