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葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料

描述:葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料Smartdex G-10 蛋白分离:Smartdex G-10系列介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)介质,其工作原理主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

更新时间:2022-07-15
产品型号:Smartdex G-10 蛋白分离
厂商性质:经销商
详情介绍

葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料Smartdex G-10 蛋白分离

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Smartdex G-10系列介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)介质,其工作原理主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

  葡聚糖凝胶是一种具有三维网状结构的高分子化合物,它是由葡聚糖加入交联剂通过醚键互相交联聚合而成的,交联度越大,网孔结构就越紧密,吸水后的体积膨胀就越小,能允许进入凝胶内部的分子的分子量也就越小,反之亦然。层析时,大于凝胶孔径的大分子,被阻于凝胶相外,沿着凝胶颗粒之间的间隙走,下移速度最快,故最先洗脱下来,中分子物质部份进入凝胶内部,洗脱速度为其次,而小分子物质因全部进入凝胶,受到阻力大,故最后被洗脱下来,如此物质得到分离。

   型号G表明每克于凝胶吸水量的多少,例如G-10表明每克干凝胶吸水1.0克。这表征了凝胶所能膨胀的倍数,亦间接表征了凝胶孔径的大小。


表1.Smartdex G-10产品性能

项目

性能

颗粒大小 (干)

100-200目

分离范围 (球蛋白)

<7×102 Da

溶胀体积(ml湿胶/g干粉)

2.0-3.0

pH稳定性

pH 2-13

2.装柱说明


2.1凝胶的预处理

Smartdex G-10 为于粉,初次使用前必须进行预处理。溶胀过程中严禁使用磁力搅拌,以免使微球破碎。

加入足够的水或缓冲液进行溶胀,室温3h 以上或水浴 90℃、1h。如果室温溶胀则需要进行真空脱气,然后将溶胀好的微球按照3∶1(v/v)加入水或缓冲液搅拌使其形成均匀的75%胶悬液。如果是重复使用的可以将 20%乙醇倾去,加水或缓冲液搅拌均匀成75%的胶悬液。

2.2 Smartdex G-10 的装填

2.2.1重力柱的装填

1)取合适规格的重力层析柱,装入下垫片,加入适量纯水润洗柱管和垫片,关闭下出口。

2)将溶胀好的介质混合均匀,用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的75%),打开下出口流干保护液。3)加入适量纯水冲洗介质,待柱管中液体重力流干后,关闭下出口。4)装入润洗后的上垫片,确保垫片与填料之前没有空隙,且保持水平。

5)装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡,暂不使用时则加入保护液,4-30℃保存。

2.2.2 层析柱的装填

装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积,根据所需装柱高度计算所需介质体积,公式如下∶

V=1.15mh

V∶所需介质体积 ml 1.15∶压缩系数r∶柱管半径 cm h∶装填高度 cm

注意∶介质实际体积占所取悬液总体积的 75%。

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2cm 的去离子水。2)将填料悬浮起来,小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。


3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。4)打开层析柱底部出口,开启泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速,可以用你所使用泵的最大流速,这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意∶在随后的色谱程序中,不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后,在最后的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。5)关闭泵,关闭层析柱出口。

6)如果使用储液器,去除储液器,将分配器置于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料Smartdex G-10 蛋白分离过程


3.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 um 滤膜过滤。

平衡液为蛋白纯化后,用干保护蛋白的溶液(例如;PBS等),根据客户需求自行选择。

3.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤,减少杂质,防止堵塞柱子。

3.3 样品纯化1平衡

上样之前,用平衡液至少平衡 5-10个柱体积,或直到基线稳定。含去垢剂的溶液可能需要平衡更长时间。2)上样和洗脱

推荐上样体积为柱体积的 10%以内。脱盐时最大样品量可至 30%柱体积。使用重力柱纯化时。待样品进入填料后,继续加入平衡液进行洗

脱,使用预装层析柱纯化时,可以通过上样管或样品环来上样。分管收集洗脱液,样品进入填料开始,按昭固定体积(例如 1ml/管)收集

样品,检测每管蛋白浓度和盐浓度,计算回收率和脱盐效率。预装层析柱纯化流速最高不能超过装柱流速的 70%。

凝胶过滤是一种非吸附性色谱技术,所有的样品物质都应在一个柱体积之内洗脱出来。完成一次操作后,如仍用同一种缓冲液,色谱柱不需要再平衡。3)再生

再生通常用水冲洗2 倍柱体积,然后用缓冲液冲洗2-3倍柱体积,如果不立刻使用,则用20%乙醇平衡后,4-30℃C保存。对不同的样品,建议大约5次循环后,采用完整的在位清洗(CIP)。

4.清洗及保存

在位清洗∶为除去变性蛋白或脂肪,有时需要对脱盐柱进行原位清洗。常用的清洗液为0.1-0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂。

1)加入一倍的柱体积0.1-0.2 M NaOH,依靠重力或者低流速清洗介质。

2)用足够量的去离子水,冲洗介质,直至 pH 值至中性。

3)用至少三倍柱体积 20%乙醇溶液冲洗介质,然后做好色谱柱的密封,置于2-8℃保存。

注∶不建议介质多次重复再生和使用。

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