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组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法

描述:组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法 Ni IDA Beads填料可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签(6xHis-tagged)蛋白的纯化。

更新时间:2024-02-04
产品型号:Ni IDA Beads填料
厂商性质:经销商
详情介绍

组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法 Ni IDA Beads填料

      Ni IDA Beads可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签(6xHis-tagged)蛋白的纯化。它是以4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸(IDA),螯合镍离子(Ni2+)后,可以形成比较稳定的平面四边形结构,从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位,达到结合目的蛋白的效果。但是,这样的结构比较容易受到其他小分子的进攻,镍离子易被还原或者被螯合,从而破坏其化学结构,无法结合目的蛋白。Ni IDA Beads具有载量高,性能和价值匹配等优点。


NI IDA示意图


1. Ni IDA Beads产品性能

项目

性能

基质

4%琼脂糖凝胶

载量(/mL基质)

>40mg 6XHis-tagged protein

微球粒径(μm

45–165

最大压力

0.1 MPa, 1 bar

储存缓冲液

20% 乙醇的1XPBS

储存温度

4°C-30°C


2.纯化流程

2.1 缓冲液的准备

可使用下列推荐缓冲液,也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系,基本原理就是低咪唑上样,高咪唑洗脱。缓冲液在使用前尽量用0.22 μm 或者0.45 μm 滤膜过滤除菌。具体配置方法见表2。


组氨酸标签蛋白亲和纯化介质过滤层析法 Ni IDA Beads填料纯化蛋白流程:

2.2.1 细菌或酵母表达的蛋白

1)挑取单菌落到培养基中,根据载体使用说明,加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2)表达结束后,将培养液转移到离心杯中,7,000 rpm(7,500×g),离心15min 收集菌体,然后按照菌体∶Lysis Buffer=1∶10(WNV)加入

Lysis Buffer,加入终浓度为 1mM的 PMSF。加入溶菌酶(工作浓度为 0.2-0.4 mg/ml,如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE,可以不加溶菌酶),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合)。

3)将菌体沉淀悬浮起来,(如果菌液浓度高,也可考虑加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I),混匀,放置于冰上,然后冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。

4)将澄清的破碎液转移至离心管中,10,000 rpm(15,000×g),4℃离心 20-30 min。取上清,置于冰上备用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1)将细胞培养液转移至离心杯,5.000 rpm(3.800×g);离心10min,收集菌体得上清,如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质,即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质,需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。2)对于大量体积的上清,需加入硫酸铵沉淀浓缩后,蛋白还需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.3 Ni IDA Beads 重力柱的装填

1)取合适规格的重力层析柱,装入下垫片,加入适量纯水润洗柱管和垫片,关闭下出口。

2)将 Ni IDA Beads 混合均匀,用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的一半),打开下出口流干保护液。

3)加入适量纯水冲洗介质,待柱管中液体重力流干后,关闭下出口。

4)装入润洗后的上垫片,确保垫片与填料之前没有空隙,且保持水平。

5)装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡,暂不使用时则加入保护液,4-30℃保存。


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